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类器官专题｜你问我答，有问必答！
类器官：Q & A
Q 1：类器官必须无血清培养是吗？
有加 FBS 的类器官 Protocol 吗？
A: 限定条件下扩张类器官时，建议避免使用血清。但在多个实验室开发培养基中都有血清的存在，例如 Hans Clevers 教授实验室建立的肠道类器官培养系统，因为当组织特异性类器官模型需要 Wnt3a 时， Wnt3a 条件培养基中含有一定量的 FBS (FCS)，使 Wnt3a 活性达到最佳。Wnt3a 的替代物可以完美的完成 Wnt3a 的工作，无血清条件容易实现Q 2：肠道类器官常用的 Biomarker 有哪些啊?肠道类器官中包含多种分化细胞，经典的隐窝-绒毛样结构被认为是构建成功的特征，肠道干细胞标志物 Lgr5 的表达一般通过荧光定量 PCR 或 Lgr5-荧光报告基因成像检测。肠分化基因标志 CDX2 也可以通过荧光定量 PCR 检测。常见的分化谱系可通过标志物染色检测，如Paneth细胞——溶解酶 (Lysozyme)；肠细胞——Villin/EPCAM；杯状细胞——Mucin 2；肠内分泌细胞-Somatostatin、Chromogranin A；表皮细胞——E-cadherin；增殖细胞——Ki-67
Q 3：类器官建成后需要测序验证后才能使用吗？文章需要给出测序数据证明这个类器官的可靠性吗？类器官构建后，类器官的表征是非常重要的，在鉴定类器官后可进行下游应用。通常通过/以类器官的细胞组成、结构、功能和表型的稳定性来评估论
• 高分辨率显微镜可以用于评估类器官的数量和形态。• 类器官内的细胞活
力可以通过发光细胞活力测定来确定。• 同样的，用于组织学的包埋类器官可用于观察样品的内部，并确保在类器官的核心内不存在坏死。通过使用样本组织特异性细胞标记物和免疫荧光成像可评估类器官的分化状态。3) 类器官功能。不同组织类器官需要对相应组织功能再现进行评估，例如胃类器官中的酸分泌和肠类器官中的粘液分泌功能
目前未有是否“必须”测序的说法，但毫无疑问，对于存在异质性的类器官来说，测序无疑是一种鉴定、质控以及分析的强大工具。
表 1. 类器官研究中用于评估/表征类器官结构和功能的方法部分报道
基于类器官的培养物的建立需要考虑构成类器官培养物的主要成分——细胞、可溶性因子和基质、物理因素——以及这些成分的成功整合
Q 4：类器官跑 WB 现实吗？需要的量是不是很大？类器官可以做 Western blotting，常见于类器官的鉴定和药物处理后相关指标检测。具体的用量和蛋白表达量有关，一般会先检测蛋白浓度。
Q 5：利用类器官进行药物筛选如何操作？如何对类器官培养物进行药物筛选可参考方案
Q 6：类器官培养是否有细胞密度依赖性？体外培养的细胞系具有细胞密度依赖现象，指的是正常细胞生长至汇合单层时，由于细胞变得比较拥挤，与培养基接触的表面积也减小，同时培养基中的营养物质被逐渐消耗，代谢产物不断积累，使细胞停止分裂增殖，即密度依赖性生长抑制。研究表明类器官中可以观察到密度依赖性效应
Q 7：请问怎样判断一个组织用哪种酶消化呢？
酶解法作为单细胞悬液制备常用方法之一，通过利用特定酶进行相应的化学反应除掉一些特定结构，适合将小块组织消化成为单个细胞。
胶原酶是单细胞组织消化的重要酶种。胶原酶消化在单细胞样本制备过程中，是必不可少的一步。
另外，组织解离常见的消化酶还有胰蛋白酶、脱氧核糖核酸酶Ⅰ、透明质酸酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、弹性蛋白酶，不同酶适用于不同的组织类型，根据类器官类型 (需要分离细胞的组织) 使用合适的酶。
Q 8：不同肿瘤患者来源的腹水培养类器官方式相同吗？
目前，恶性肿瘤腹水构建的类器官相关报道较少，例如卵巢癌患者腹水建立的类器官培养中参考了相应肿瘤类器官的培养，添加了皮质醇(Hydrocortisone)、雌二醇(Estradiol) 。结直肠癌腹水建立的类器官培养条件与其癌症组织相同，胃癌腹水建立的类器官条件也是参考了相应癌症类器官[12]。各方案有差异。而 CN110129270B 专利所述了一种卵巢癌、肺癌、乳腺癌、肝癌腹水培养方法。
细胞因子
小分子化合物
染料 & 抗体
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参考文献
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3. Chengyong He, Shaohua Ma, and Zhenghong Zuo, et al. Black Phosphorus Quantum Dots Cause Nephrotoxicityin Organoids, Mice, and Human Cells. Small. 2020 Jun;16(22):e2001371.
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