干货分享 | 眼花缭乱的肿瘤模型？深度解析！（二）
患者来源的肿瘤异种移植模型 (Patient-derived tumor xenografts models)，即 PDX 模型，通过手术从癌症患者身上切下的肿瘤碎片直接移植到免疫缺陷小鼠体内[3][4]。PDX 模型保留了肿瘤微环境的结构，与母体肿瘤具有相似的病理组织学和遗传特征，并且表现出相似的抗癌治疗敏感性。
小鼠的各个部位都可以作为肿瘤组织移植部位来创建 PDX 模型，但一般来说，原位、皮下和尾静脉部位较为常用的[4][5]。图 1. PDX 模型的构建[1]。
(1-3) 取材移植：来自患者肿瘤的手术标本被分成小块并移植到麻醉的免疫功能低下的小鼠体内。(4) 肿瘤生长：需要 1 - 6 个月。(5-6)处理分析：一旦肿瘤在 F0 小鼠中生长，异种移植物就会被切除并切成小块。可对部分肿瘤组织进行肿瘤特征分析，例如全外显子组测序 (WES)、RNA 测序 (RNA-seq) 和拷贝数变异 (CNV) 分析。(7) 留样储存/扩增：将残余的 PDX 肿瘤储存在液氮中，或进一步移植到免疫活性小鼠体内进行扩增，如此重复操作形成移植瘤第 2 代、第 3 代等。
注：通常来讲，F2 或 F3 PDX 肿瘤可用于癌症生物学研究，例如药物敏感性筛选、鉴定生物标志物等。为了保证与原发肿瘤的一致性, PDX 模型传代次数一般不超过 10 代。
近年来，人们开始有了新的探索，在人源化 PDX 模型中，将人的免疫系统和人的肿瘤组织一起移植到模型中，然后在患者肿瘤植入的同时在免疫缺陷小鼠体内重建人的免疫系统[4]。
人源化小鼠主要分为三类：基因人源化小鼠、人源化器官小鼠、人源化免疫系统小鼠[4]。
基因人源化小鼠即小鼠中的某个或某些基因被人类基因、基因组序列或调节元件取代。基因人源化之后，小鼠可以表达出完整人源蛋白或包含人源特定结构域的嵌合蛋白。
在人源化器官小鼠模型中，小鼠携带特定的人类器官。以肝细胞为例，最早的用人肝细胞大量再生小鼠肝脏的报道是由 Dandri 和 Mercer 等人在 2001 年发表的[7][8]。后来，Grompe 和同事培育出人源化 FRG 小鼠模型 (图 3)[9]。
图 3. 人源化小鼠肝脏模型 (FRG)[9]。
首先培育出 Fah (酪氨酸分解代谢途径中的一个基因) 被删除的小鼠。Fah 活性的缺乏会导致酪氨酸代谢物的积累，这些代谢物对天然肝细胞有毒，会引起慢性肝损伤。NTBC 可阻断有毒代谢物的积累，防止肝损伤，使动物在用药期间保持健康状态。Fah-proficient 肝细胞的移植导致天然细胞的替换以及供体细胞对肝脏的重新填充。FRG (Fah−/− Rag-2−/−Il2rg−/− triple mutant mouse) 是敲除小鼠模型，而不是转基因小鼠模型，因此不会发生基因型逆转，可连续移植，这一特征是 FRG 模型最重要的优点之一，其可以通过胶原酶灌注从一只再生小鼠中回收人肝细胞并将其移植到其他小鼠中。
也就是说，即使是少量接受初次移植的小鼠也可以通过连续移植来产生大量人源化小鼠以进行大型研究，或者可以维持独特或珍贵的人类基因型，并将其传递给后代小鼠，直至其寿命结束。
人源化免疫系统小鼠，即在免疫缺陷小鼠和人类细胞中建立的人源化免疫系统小鼠将重建小鼠免疫系统[4]。目前，被用于建立功能性人体免疫系统的人体免疫细胞主要有两种，PBMCs 和 CD34+HSC，用于建立三种模型 (见表2):(A) Hu-PBL-SCID 模型：人外周血单核细胞 (PBMC);(B) Hu-SRC-SCID 模型: 造血干细胞 (HSC);(C) BLT 模型: 人胎儿组织、胸腺或肝脏移植到免疫缺陷小鼠中[10]。
表 2. 人源化免疫系统小鼠模型的建立[4]。
▐ PBMCs: Hu-PBL 模型
最简单、最经济的人源化方法是在免疫缺陷小鼠体内植入人类白细胞，称为 Hu-PBL。
该方法于 1988 年首次使用 CB17-scid 小鼠进行描述[11]，并已被广泛用于研究自身免疫和感染性疾病中的人类免疫应答[12]。
图 4. Hu-PBL模型[12]。
通过静脉/腹腔注射将 PBMCs 植入成年免疫缺陷小鼠体内。人类白细胞可从 PBMCs、脾脏或淋巴结中获得。在该模型中可检测到低水平的人 IL-1β, GM-CSF, IFN-y, IL-10, IL-2 和IL-5，这可能有助于人细胞的存活。T 细胞是存在于小鼠宿主体内并具有功能的主要免疫亚群，通常将 20 × 106 个 PBMCs 注射到 NSG 小鼠体内，植入 4 周后，小鼠外周血中通常会出现约 50% 的人 CD45+ 细胞。约 90% 的人 CD45+ 细胞是 CD3+T 细胞，具有活化或记忆表型。
例如，可在 Hu-PBL-SCID 模型中使用恶唑酮 (Oxazolone) 来创建溃疡性结肠炎模型[13]。作者选用患有溃疡性结肠炎（UC） 、特应性皮炎（AD） 的人和健康志愿者，将hPBMC 植入到非肥胖糖尿病-严重联合免疫缺陷白介素 -2Rγ (null) (NOD-SCID IL2Rγ (null)) 小鼠中，然后使用 Oxazolone 诱导结肠炎[13]。
该模型非常适合研究体内人类 T 细胞功能，但由于存在致命的异种移植物抗宿主病 (GVHD)，实验窗口期较短，通常在 4-8 周内。
▐ CD34+ 干细胞: Hu-CD34+ 和 BLT 模型
CD34+模型
图 5. Hu-CD34 模型[12]。
造血干细胞 (HSCs) 来源于动员后的外周血干细胞、骨髓、胎肝或脐带血，经静脉 (i.v.)、腹腔 (i.p.) 或股骨内 (intra femoral, i.f.) 途径注入受照射的新生或成年免疫缺陷小鼠体内。
HSC 的来源：人脐带血、成人骨髓、粒细胞集落刺激因子（G-CSF）或胎儿肝脏动员的 PBMCs； 注射途径：静脉注射（面部或尾静脉）或成年小鼠股骨内，以及静脉注射（心内或肝内）新生小鼠； 受体小鼠的年龄、品系和性别：与成年小鼠相比，新生或年轻小鼠（4 周以下）可以加速 T 细胞发育。
该模型的优点是开发出完整的人类免疫系统，但人类 T 细胞是在小鼠胸腺上培养的，并且受到 H2 限制，还观察到人类粘膜免疫系统发育不良。
BLT 模型
BLT 模型通过肾包膜下移植人胎肝和胸腺并静脉注射自体胎肝 HSC 建立。与 Hu-SRC-SCID 模型一样，人类造血细胞的所有谱系都会发育。然而，BLT 小鼠还发育出强大的人类粘膜免疫系统，并且人类 T 细胞在自体人类胸腺中进行培养，并且受到 HLA 限制。
图 6. BLT 模型[12]。
将胎儿肝脏和胸腺碎片植入受辐射的成年免疫缺陷小鼠的肾被膜下，并静脉注射来自同一胎儿肝脏的造血干细胞。
此外，在大多数实验室中，BLT 模型小鼠会出现一种消耗性 GVHD 样综合征，从而限制了实验的时间窗口。
Hu: Humanized mouse, 人源化小鼠;
HSC: Hematopoietic stem cell, 造血干细胞;
PBMC: Peripheral blood mononuclear cell，外周血单个核细胞;
SCID: Severe combined immunodeficiency, 重症联合免疫缺陷;
PBL: Peripheral blood lymphocyte, 外周血淋巴细胞;
SRC: SCID-repopulating cell, SCID 小鼠重建/再植细胞;
BLT Humanized Mouse Models: 骨髓-肝脏-胸腺 (BLT) 人源化小鼠模型;
GVHD: Graft Versus Host Disease, 移植物抗宿主疾病; 是造血干细胞移植后在患者体内重建的供者来源的免疫细胞攻击受者脏器造成的组织损伤，是异基因 HSCT 特有的并发症，具有致命性。
Nitisinone 是一种口服有效的，具有竞争性和可逆性的 4-羟苯丙酮酸二加氧酶 (4-HPPD) 抑制剂，其 IC50值为 173 nM。Nitisinone 能以剂量依赖的方式促进酪氨酸的积累。Nitisinone 可用于遗传性酪氨酸血症 1 型 (HT-1) (罕见的遗传性疾病) 和白化病的研究。 |
Oxazolone 是一种半抗原化剂，可诱导急性或慢性大肠炎症，用于构建结肠炎模型。 |
Dextran sulfate sodium salt (MW 35000-45000) 一种脱水葡萄糖的聚合物，可用于诱导炎症性肠病（IBD）模型。 |
Complete Freund’s adjuvant (CFA) 十肽，一种有效的胆囊收缩素受体激动剂，可用于诱导胰腺炎模型。 |
| MOG (35-55) (TFA) 中枢神经鞘的一个次要成分，可用于诱导脑脊髓炎模型。 |
[2] Okada S, et al. Application of Highly Immunocompromised Mice for the Establishment of Patient-Derived Xenograft (PDX) Models. Cells. 2019 Aug 13;8(8):889.
[3] Yoshida GJ. Applications of patient-derived tumor xenograft models and tumor organoids. J Hematol Oncol. 2020 Jan 7;13(1):4.
[4] Abdolahi S,et al. Patient-derived xenograft (PDX) models, applications and challenges in cancer research. J Transl Med. 2022 May 10;20(1):206.
[5] Dobrolecki LE,et al. Patient-derived xenograft (PDX) models in basic and translational breast cancer research. Cancer Metastasis Rev. 2016 Dec;35(4):547-573.
[6] Lute KD,et al. Human CTLA4 knock-in mice unravel the quantitative link between tumor immunity and autoimmunity induced by anti-CTLA-4 antibodies. Blood. 2005 Nov 1;106(9):3127-33.
[7] Dandri M,et al. Repopulation of mouse liver with human hepatocytes and in vivo infection with hepatitis B virus. Hepatology. 2001 Apr;33(4):981-8.
[8] Mercer DF,et al. Hepatitis C virus replication in mice with chimeric human livers. Nat Med. 2001 Aug;7(8):927-33.
[9] Strom SC, et al. Chimeric mice with humanized liver: tools for the study of drug metabolism, excretion, and toxicity. Methods Mol Biol. 2010;640:491-509.
[10] Allen TM, et al. Humanized immune system mouse models: progress, challenges and opportunities. Nat Immunol. 2019 Jul;20(7):770-774.
[11] Mosier DE, et al. Transfer of a functional human immune system to mice with severe combined immunodeficiency. Nature. 1988 Sep 15;335(6187):256-9.
[12] De La Rochere P, et al. Humanized Mice for the Study of Immuno-Oncology. Trends Immunol. 2018 Sep;39(9):748-763.
[13] Nolte T, et al. Oxazolone and ethanol induce colitis in non-obese diabetic-severe combined immunodeficiency interleukin-2Rγ(null) mice engrafted with human peripheral blood mononuclear cells. Clin Exp Immunol. 2013 May;172(2):349-62.