真核细胞中的两大降解系统分别被授予了诺贝尔化学奖和诺贝尔生理学或医学奖！其中，利用自噬-溶酶体途径降解靶蛋白的分子包括 LYTAC、AUTAC、ATTEC，近年来逐渐火热，研究潜力可谓是不容小觑!
缩略词(上下滑动查看更多） PROTAC: PROteolysis TArgeting Chimeras, 蛋白水解靶向嵌合体
TPD: Targeted protein degradation, 靶向蛋白质降解
LYTAC: Lysosome-Targeting Chimaera, 溶酶体靶向嵌合体
AbTAC: Antibody-based PROTAC, 基于抗体的 PROTAC
ATTEC: Autophagosome-Tethering Compound，自噬小体绑定化合物
POI: Protein of interest, 目标蛋白
除了 PROTAC 之外，许多不同的靶向蛋白质降解 (TPD) 策略正在出现，尤其近年来出现的通过溶酶体途径的 TPD 策略， 如LYTAC、AbTAC、ATTEC、AUTAC、双特异性核酸配体嵌合体和 AUTOTAC……
图 1. 溶酶体依赖性蛋白质降解策略[1]。
A. LYTAC 和其他通过溶酶体途径降解技术的示意图。B. LYTAC 分子和双特异性适体嵌合体通过接合 POI 和溶酶体靶向受体 (LTR) 来降解膜蛋白和细胞外分子。AbTAC 利用膜 E3 连接酶 RNF43，通过溶酶体依赖性方式降解膜蛋白; GlueTAC 利用溶酶体分选序列 (LSS) 来促进溶酶体降解；AUTAC、ATTEC 和 AUTOTAC 促进 POI 特异性自噬体的形成，并随后通过溶酶体降解 POI。
与只能降解某些细胞内蛋白质的基于蛋白酶体的 TPD 相比，基于溶酶体的 TPD 具有去除蛋白质聚集体、破坏多余细胞器、膜和细胞外蛋白质的潜力。
本期小 M 主要为大家介绍通过自噬降解多种靶点的闪亮新星 — ATTEC！
ATTEC，即一种自噬小体绑定化合物，其结构包含靶蛋白配体、连接子、和 LC3 配体三个部分。ATTEC 分子可以直接将目标蛋白 (POI) 和自噬关键蛋白 LC3 结合在一起，促进目标蛋白通过自噬-溶酶体途径降解[2]。
图 2. LYTAC、AUTAC、ATTEC 降解目标蛋白的机制[2][3]。
(A) ATTEC 分子结构及降解目标蛋白机制。(B) LYTAC、AUTAC、ATTEC降解目标蛋白 (POI) 的机制: (Ⅰ) LYTAC 分子由靶向 POI 的抗体和 6-磷酸甘露糖 (M6P) 共价连接组成，在受体介导的内化后实现 POI 在溶酶体降解。(Ⅱ) AUTAC分子一端为 POI 配体，另一端为自噬招募标签，可触发 POI 的 K63 泛素化，通过选择性自噬途径进行降解。(Ⅲ) ATTEC 连接 POI 和 LC3，通过自噬-溶酶体途径降解 POI。
与 PROTAC 和 AUTAC 相比，ATTEC 不依赖于泛素化，是一种更直接的策略。与 LYTAC 相比，ATTEC 分子量更低，因而具有较好的成药潜力 (图 2)。值得注意的是，ATTEC 不仅可降解蛋白质，还可降解包括脂类的非蛋白质类生物大分子[2]。小 M 也为大家贴心地整理好了 ATTEC 与 PROTAC、AUTAC、LYTAC 的区别 (表 1)~
表 1. ATTEC 与 PROTAC、AUTAC、LYTAC 之间的比较[3]。
图 3. 一系列可连接突变 mHTT 和 LC3 的分子胶化合物[4]。
mHTT 是一种亨廷顿病 (HD) 致病蛋白，具有扩展的多聚谷氨酰胺 (polyQ) 延伸。基于新型高通量药物筛选平台，作者筛选出了一系列可连接 mHTT 和 LC3 的 ATTEC 分子，分别为 10O5 (GW)、8F20 (Ispinesib)、AN1 、AN2。实验结果表明，这些化合物可以在细胞内和动物模型体内将 mHTT 靶向自噬体并降解 mHTT，而不影响 wtHTT 的水平，还可以缓解 HD 相关表型 (图 4)。
图 4. TTEC 分子降解细胞中 mHTT，并在细胞及小鼠 HD 模型中缓解 HD 相关表型[4]。
(A) 在自噬抑制剂 NH4Cl、Chloroquine、bafA1 或自噬增强剂 Rapamycin 存在下ATTEC 分子对永生化成纤维细胞中 mHTT 含量影响。(B) 用 ATTEC 分子处理 HD 患者 iPS 细胞来源的纹状体神经元，并对神经元特异性微管蛋白标记物 TUBB3 进行免疫染色。(C-E) 腹腔注射 0.5 mg/kg ATTEC 分子后小鼠行为测试，显示 HD 相关表型有所改善。
2021 年 7 月，鲁伯埙教授团队又将上述 LC3 配体 10O5 (GW) 和 AN2 (DP) 通过 linker 分别与脂滴配体 (Sudan IV、Sudan III) 连接，开发了可连接脂滴 与 LC3 的 ATTEC 分子 (LD-ATTEC1/2 /3 /4 , C1-C4)。实验结果表明这些化合物能几乎完全清除 LD，并由 LC3 和自噬介导，还在肝脂质沉积症小鼠模型中缓解了 LD 相关表型。在这项工作中，作者利用 ATTEC 技术首次实现了对脂类的非蛋白质类生物大分子的降解，实现了从蛋白向非蛋白物质的突破[5]。
图 5. LD•ATTECs (C1-C4) 的分子结构图[5]。
同年 11 月，四川大学欧阳亮教授使用上述 LC3 配体 GW 连接 BRD4 抑制剂 (JQ1) 得到了 ATTEC 分子 (化合物 10f)。化合物 10f 通过自噬途径有效降解 BRD4 蛋白，并在多种肿瘤细胞中表现出良好的抗增殖活性 (图 6A)[6]。2022 年 5 月第二军医大学盛春泉教授使用上述 LC3 配体 8F20 (Ispinesib) 连接烟酰胺磷酸核糖转移酶 (NAMPT) 抑制剂 (MS2) 得到了 ATTEC 分子 (化合物 A3)。结果表明化合物 A3 可通过自噬-溶酶体途径有效降解 NAMPT，这项工作也为 NAMPT 的靶向降解提供了一种新思路 (图 6B)[7]。
图 6. ATTEC 分子 (A) 化合物 10f 和 (B) A3 的结构[6][7]。
今年 10 月，鲁伯埙教授团队使用前期得到的 LC3 配体 GW 连接线粒体外膜蛋白 (TSPO) 配体，得到了可以靶向清除受损线粒体的 ATTEC 分子(化合物 mT1)。实验结果表明，化合物 mT1 可通过 LC3 和自噬相关蛋白 (ATG) 依赖性自噬诱导线粒体降解，并减弱了 PD 细胞模型和唐氏综合症 (DS) 类器官模型中的疾病表型。这项研究证明了 ATTEC 分子用于降解线粒体的可能性，证实了 ATTEC 降解细胞器的能力，为线粒体相关疾病的研究提供了新策略。
图 7. ATTEC 分子 (mT1) 诱导线粒体降解，并减弱 PD 细胞模型和 DS 类器官模型中的疾病表型[8]。
(A)化合物 mT1 结构式。(B) HeLa 细胞用 mito-Keima 转染，然后用 DMSO、mT1、CCCP 或 mT1 + CCCP 处理, 对 mito-Keima 的红色信号进行量化，显示 mT1 具有优先降解受损的线粒体。(C) HeLa 细胞经 mT1 处理 48 h 后用 TOM20 抗体进行免疫荧光染色。(D-E) WT 或 LC3B/ATG5 KO 293T 细胞用 mT1 处理 48 h 用 TOM20 抗体进行免疫荧光染色。(F-G) 用 mT1 处理整倍体 (euploid 细胞) 和 DS 组 (trisomy 细胞) 中的皮质神经元，用 TOM20 和 TUJ1 抗体对进行免疫染色，显示 mT1 处理减少了 DS 细胞皮质神经元中线粒体聚集。
ATTEC 技术极大地扩展了降解剂的潜在应用，为靶向降解领域开辟了新的研究途径。尽管关于 ATTEC 的研究目前主要集中在致病蛋白，但在降解蛋白质聚集体、脂质、DNA/RNA 分子、过氧化物酶体、核糖体、受损的线粒体，甚至微生物病原体等方面也具有巨大的潜力[3]。
今天，小 M 为大家介绍了利用自噬-溶酶体途径降解靶蛋白的闪亮新星——ATTEC，并盘点了近几年涌现的 ATTEC 分子。可以看到，ATTEC 分子在降解致病蛋白、脂质、细胞器等多种靶点方面有着巨大的潜力，其结构特点也使其具有较好的成药潜力。但目前已知的 LC3 配体小分子数量和种类仍然十分有限，另外，所形成的嵌合体也有待科学家们的深入研究。
Ispinesib
KSP 抑制剂，可作为 ATTEC 分子中 LC3 受体配体。 |
LC3-mHTT-IN-AN1 连接 mHTT 与 LC3 的 ATTEC 分子。
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LC3-mHTT-IN-AN2 连接 mHTT 与 LC3 的 ATTEC 分子。 |
LD-ATTEC2 /3 /4 连接脂滴 与 LC3 的 ATTEC 分子。 |
| JQ1 BRD4 抑制剂。 |
CCCP 氧化磷酸化 (OXPHOS) 解偶联剂。 |
[1] Zhao L, et al. Targeted protein degradation: mechanisms, strategies and application. Signal Transduct Target Ther. 2022 Apr 4;7(1):113.
[2] Zeng Y, et al,. Degradation of Cyclin-Dependent Kinase 9/Cyclin T1 by Optimized Microtubule-Associated Protein 1 Light Chain 3 Beta-Recruiting Coumarin Analogs. J Med Chem. 2023 Sep 28;66(18):12877-12893.
[3] Ding Y, et al,. Emerging New Concepts of Degrader Technologies. Trends Pharmacol Sci. 2020 Jul;41(7):464-474.
[4] Li Z,et al,. Allele-selective lowering of mutant HTT protein by HTT-LC3 linker compounds. Nature. 2019 Nov;575(7781):203-209.
[5] Fu Y, et al. Degradation of lipid droplets by chimeric autophagy-tethering compounds. Cell Res. 2021 Sep;31(9):965-979.
[6] Pei J, et al. Developing potent LC3-targeting AUTAC tools for protein degradation with selective autophagy. Chem Commun (Camb). 2021 Dec 7;57(97):13194-13197.
[7] Dong G, et al. Ispinesib as an Effective Warhead for the Design of Autophagosome-Tethering Chimeras: Discovery of Potent Degraders of Nicotinamide Phosphoribosyltransferase (NAMPT). J Med Chem. 2022 Jun 9;65(11):7619-7628.
[8] Tan S, et al. Targeted clearance of mitochondria by an autophagy-tethering compound (ATTEC) and its potential therapeutic effects. Sci Bull (Beijing). 2023 Oct 26:S2095-9273(23)00721-1.