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干货分享 | 如何做 RNA 干扰实验?(常见问题+解决方案)
RNA 干扰技术是研究基因功能的一种强大工具,这种技术有可能直接从源头上让致病基因“沉默”。今天就让我们一起来学习如何做 RNA 干扰实验!
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设计 siRNA
如果您希望设计自己的 siRNA,可根据以下原则来设计 siRNA[3][4][5]。然后,通过化学合成、体外转录、载体或 PCR 产物表达等方式进行制备相应的 siRNA。
一些在线网站可以基于一定规则设计出 siRNA 序列。如,http://biodev.extra.cea.fr/DSIR/DSIR.html; http://sidirect2.rnai.jp/。2
siRNA 套装
为了满足广大研究者利用 RNA干扰的方法去探究基因功能的需求,MedChemExpress (MCE) 专门推出预设计 siRNA 套装。
我们的预设计 siRNA 套装针对靶基因 (仅限人、小鼠、大鼠) 的不同区域设计三对 siRNA,我们保证在标准使用条件下 (转染效率 80% 以上) 至少一对 siRNA 的 mRNA 水平沉默效率达 70% 以上。套装产品包括 3 对 siRNA,附赠阴性对照、阳性对照、FAM 标记阴性对照 siRNA。MCE 提供的 siRNA 为冻干粉形式,收到产品后,请于 -20℃ 或 -80℃ 保存,可以稳定保存一年。 使用前瞬时离心,用 RNase-free H2O 或灭菌 ddH2O 配制成 20 μM 储存液。 配置 20 μM 储存液需要向 5 nmol 的 siRNA 中加入 250 μL 灭菌水。 20 μM 储存液分装保存避免反复冻融。 荧光标记的 siRNA 需要避光保存。
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siRNA 转染
常见转染的方法有:磷酸钙共沉淀、电穿孔法、DEAE 葡聚糖和 polybrene、机械法 (例如,显微注射和基因枪)、阳离子脂质体试剂,其中使用阳离子脂质体试剂转染是目前最常用的转染方法。MCE 推出最新转染试剂 HY-K2017 (siRNA/miRNA Transfection Reagent),可用于高效率转染 siRNA。对于一些难转染的细胞如原代细胞、干细胞和 B 细胞系,可以考虑选择电穿孔法。图 4. 检测 siRNA 的转染效率[6]。
此外,客户可以通过检测转染了 FAM 标记阴性对照的细胞的荧光信号来确定转染效率 (图 3)。通过转染了 GAPDH 阳性对照的细胞确认转染实验中操作是否有问题。如果 GAPDH mRNA 表达降低,则证明转染实验中操作没有问题,GAPDH siRNA 正常发挥作用。如果 GAPDH mRNA 表达没有变化,则证明操作出现失误,转染失败。
▐ 2. 同样的 siRNA 为什么在细胞 A 中有效,在细胞 B 效果不好?不同细胞可能转染效率不一样,基因表达水平也不一样,这些都与 siRNA 的作用效率有关。▐ 3. 如何设计用于 RT-PCR 的引物?RT-PCR 的引物应该设计在 siRNA 靶向位点的两侧,而不是同侧。设计于同侧的 PCR 引物可能导致假阴性结果。另外,RT-PCR 结果会因为靶基因 mRNA 降解时间不同、细胞内靶基因 mRNA 丰度不同而导致假阴性结果,推荐使用多种检测方式包括 RT-PCR、Northern、Western 检测来验证 siRNA 的效果。▐ 4. 如何改善基因沉默的效果?
提高转染效率:首先可依据转染试剂说明书进行转染条件 (细胞密度,转染试剂用量,转染时间等) 优化尝试,其次可尝试在其他细胞类型上进行转染。若由于实验模型限制无法使用其他细胞,可考虑更换转染试剂或转染方法 (如电转)。 转染过程中使用无血清培养基:血清会阻碍转染试剂与 siRNA 形成复合物,进而影响转染效果。 优化 siRNA 浓度:siRNA 最佳工作浓度因不同的细胞类型及研究目的而异,这取决于 siRNA,细胞系和选择的分析方法。推荐 siRNA 工作浓度为 50 nM,也可以使用不同的浓度进行优化实验以达到最佳转染效率。但过高浓度的 siRNA 可能对细胞产生毒性。 调整细胞的生长状态:细胞生长状态不好会影响转染效率。 重新设计 siRNA:若确定转染效果尚佳,其他因素也分析没有问题的情况下,却没有达到理想的基因沉默效果,则可以尝试重新设计其他 siRNA。
转染试剂浓度过高会产生细胞毒性。 转染时的培养基中加入了抗生素,这会降低细胞转染的效率,甚至导致细胞死亡。 细胞本身状态不佳。
真核基因表达的转录和翻译发生的时间和位置不同。可能 mRNA 的下降尚未反映在蛋白量的变化上或者未达到足以检测的水平。所以一般建议蛋白检测的时间要稍稍推后。 某些蛋白表达量到一定的程度之后,足以满足细胞功能。转录出来的部分 mRNA 被降解,并没有参与蛋白翻译的过程。因此,mRNA 水平的下降可能没有引起蛋白水平下降。 某些基因有多个转录本,而且有可能每个转录本都会编码产生相应的蛋白。而设计的 siRNA 只是针对其中一个转录本,其他的转录本并未受影响,仍正常表达蛋白。 可能涉及到其他更加复杂的机制。
动物的体内环境复杂,实验周期长,对 siRNA 产品的稳定性提出了更高的要求。所以一般用于动物实验的 siRNA 需要做化学修饰。 MCE 的套装中的 siRNA 没有做过化学修饰,不适合用于动物实验。MCE 可以提供不同化学修饰的 siRNA 的定制服务。建议客户选择已经验证过效果的 siRNA 序列进行化学修饰,再用于动物实验。
[2] Zhu KY, et al. Mechanisms, Applications, and Challenges of Insect RNA Interference. Annu Rev Entomol. 2020;65:293-311. [3] Elbashir, et al. (2001) Functional anatomy of siRNA for mediating efficient RNAi in Drosophila melanogaster embryo lysate. EMBO J 20: 6877-6888.[4] Reynolds A, et al. Rational siRNA design for RNA interference. Nat Biotechnol. 2004;22(3):326-330. [5] Amarzguioui M, et al. An algorithm for selection of functional siRNA sequences. Biochem Biophys Res Commun. 2004;316(4):1050-1058. [6] Jin F, et al. Silencing herpes simplex virus type 1 capsid protein encoding genes by siRNA: a promising antiviral therapeutic approach. PLoS One. 2014;9(5):e96623. Published 2014 May 2.